Izhodišča in namen raziskave
Huntingtonova bolezen (HB) sodi med neozdravljive, smrtne nevrodegenerativne bolezni osrednjega živčevja. Je manj pogosta od Alzheimerjeve bolezni (za katero zboli več kot 10 % posameznikov, starih 65 let ali več) in Parkinsonove bolezni (ki prizadene približno 1 % starejših od 60 let in 4 % starejših od 80 let), saj njena pogostnost znaša med 3 in 7 na 100.000 ljudi, tveganje zanjo pa je izrazitejše pri ljudeh evropskega porekla. Gre za avtosomno dominantno dedno motnjo, kar pomeni, da že ena (od sicer dveh) kopij mutiranega gena zadostuje za pojav bolezni, najbolj okvarjeni del možganov pa je striatum. Mutacija se nahaja v genu HTT, ki kodira beljakovino huntingtin, pojav bolezni (ter okvirno starost bolnika ob pojavu prvih simptomov in znakov) pa določa število ponovitev nukleotidnega zaporedja citozina, adenina in gvanina – CAG. Posamezniki brez HB imajo ob rojstvu med 15 in 30 ponovitev, bolniki s HB pa več kot 36 – večje kot je število ponovitev, prej se bolezen izrazi. Ker se velika večina bolnikov (90 %) rodi s številom ponovitev med 40 in 49, se prvi znaki in simptomi običajno pokažejo okoli 40. leta starosti. Pri njihovih potomcih, ki imajo 50-odstotno verjetnost za dedovanje okvarjenega gena, pa se bolezen lahko izrazi prej, saj se v genomu spolnih celic, zlasti semenčic, število ponovitev pogosto poveča (čemur strokovno pravimo anticipacija) in narašča iz generacije v generacijo. Tipična klinična slika vključuje motnje gibanja, kognicije in čustvovanja: bolezen se običajno izrazi z motnjami koordinacije ter nenadzorovanimi zgibki, horeo, kar se sčasoma prevesi v rigidnost in negibnost. Temu je pridružen kognitivni upad, ki napreduje do demence, pogosto pa tudi nihanje razpoloženja, depresija, halucinacije in blodnje.
Trije še nerazumljeni in ključni vidiki HB so (1) selektivna dovzetnost določenega tipa živčnih celic v striatumu, t.i. striatalnih projekcijskih nevronov (SPN) za propad, (2) dolgo latentno obdobje, v katerem večina nosilcev mutiranega gena več desetletij ne izkazuje simptomov in znakov bolezni, ter (3) patofiziološki mehanizmi, ki od mutiranega HTT privedejo do nevrodegeneracije. Huntingtin ima številne biološke funkcije, zato se je o mehanizmih razvoja HB oblikovalo več hipotez, ki vključujejo spremembe v embrionalnem razvoju in delovanju mitohondrijev, žilnih celic, mikroglije ter nevralnih vezij, ki jih oblikujejo medsebojno povezane živčne celice. Namig bi se lahko skrival v pojavu, imenovanem somatski mozaicizem, ki je pri bolnikih s HB znan že več desetletij in pomeni različno dolge odseke ponovitev CAG v mutiranem genu HTT v različnih nespolnih (somatskih) celicah. Mozaicizem je izrazit v možganih, bolj izražen v nevronih kot v gliji ter večji pri osebah z zgodnejšim nastopom motoričnih simptomov in znakov od pričakovanega.
Ker si raziskovalci o pomenu somatskega mozaicizma niso bili enotni, se je uveljavila razlaga, po kateri naj bi večje število ponovitev CAG v genu HTT pomenilo hujšo okvaro (in morda tudi toksičnost) mutiranega huntingtina s posledično hitrejšim – a enakomernim – propadom SPN pri posameznem bolniku. Nagnjenost k naraščajočemu številu ponovitev CAG, t.i. »nestabilnost«, ki je podstat mozaicizma, naj bi to zgolj ojačala, vendar novi izsledki kažejo, da zgodba ni tako preprosta. Pojav motoričnih simptomov in znakov je odložen, če je med ponovitvami CAG prisotno tudi zaporedje CAA. Čeprav to ne vpliva na zgradbo beljakovine, saj obe zaporedji kodirata isto aminokislino, je stabilnost odseka s ponovitvami CAG v tem primeru večja. Na starost ob pojavu bolezni vplivajo tudi razlike v genih za beljakovine, ki uravnavajo prepisovanje in popravljanje DNK ter vplivajo na stabilnost števila nukleotidnih ponovitev, vključno s CAG. Zdi se, da je prav somatski mozaicizem pomemben del odgovora na odprta vprašanja o HB, zato so avtorji povzete raziskave želeli preveriti, kako nestabilnost prispeva k somatskemu mozaicizmu in kako le-ta vpliva na delovanje ter preživetje SPN pri bolnikih.
Metodološke značilnosti in rezultati
V raziskavo so vključili posmrtno odvzete vzorce kavdatnega jedra, največjega dela striatuma, pridobljene od 50 posameznikov s HB (tako tistih z opredeljeno mutacijo HTT, a še brez simptomov in znakov, kakor tudi bolnikov z močno napredovalo HB) ter 53 kontrolnih preiskovancev. Ker so se posamezniki s HB razlikovali po podedovanem številu CAG ponovitev in starosti ob smrti, so za vsakega izračunali t.i. število CAP (angl. CAP score) po formuli [starost (v letih) x (podedovano število ponovitev CAG – 33,66)], kar je olajšalo njihovo medsebojno primerjavo.
V zbranih vzorcih so nato z analizo jedrnih molekul RNK določili število in deleže različnih vrst možganskih celic, vključno s SPN. Pri posameznikih z nizkim številom CAP (≤ 300) oziroma tistih, pri katerih se HB še ni pojavila ali močno napredovala, je bil delež SPN le malce nižji glede na kontrolne preiskovance, pri posameznikih z visokim številom CAP (≥ 600) pa je bila izguba SPN med 80- in 99-odstotna. Na podlagi analize sporočilnih molekul RNK, ki izkazujejo stopnjo prepisovanja določenega gena v beljakovino (t.i. izražanje gena), so ugotovili, da se izražanje huntingtina med SPN, internevroni in glijo ni bistveno razlikovalo ter da izguba SPN ni sovpadala s stopnjo izražanja huntingtina. Najdba se ne sklada s prevladujočo razlago HB, ki trdi, da kopičenje mutiranega huntingtina okvari delovanje nevronov in vodi v njihov propad. Po drugi strani pa so ugotovili, da so se vsi tipi možganskih celic iz kavdatnih jeder bolnikov s HB od enakih celic kontrolnih preiskovancev razlikovali v spremembah izražanja več tisoč drugih genov, kar bi lahko odražalo posledice bolezni (vključno s propadom žil, ki prehranjujejo kavdatno jedro, kar škodi tamkajšnjim celicam).
Raziskovalce je nato zanimalo, ali obstaja povezava med številom ponovitev CAG in izražanjem genov v posamezni celici. V ta namen so se osredotočili na 6 bolnikov s klinično izraženo HB ob smrti. Določitev števila CAG ponovitev med različnimi vrstami celic je pokazala primerljivo število ponovitev med astrociti, oligodendrociti, mikroglijo in internevroni, ki je le malo odstopalo od podedovanega, v SPN pa njihovo povečanje (pri vseh šestih bolnikih ter le v mutiranem alelu). Krivulja porazdelitve deležev SPN glede na število ponovitev CAG je bila med bolniki zelo podobna: v večini SPN (med 95 % in 98 %) je prišlo do podaljšanja za 20 do 31 ponovitev CAG (v primerjavi s podedovanim številom), majhen delež SPN pa je izkazoval za vsaj 100 ponovitev daljši odsek mutiranega gena (pri čemer je največji prirast znašal 842 ponovitev CAG). Razkorak med lastno najdbo in izsledki številnih drugih raziskav, pri katerih je največji prirast znašal 100 ponovitev CAG, avtorji razlagajo s pomanjkljivostjo uporabljene metode, ki veliko bolje zaznava krajše odseke, čemur so se na račun ustreznih prilagoditev v svoji raziskavi uspešno izognili. V podporo svojim ugotovitvam navajajo tudi raziskavo Kennedy in sodelavcev iz leta 2003, ki je uporabila podobno prilagoditev in poročala o zelo dolgih odsekih (do 1000 ponovitev CAG) mutiranega HTT v striatumu bolnikov s HB.
Analiza izražanja genov v preučevanih celicah je pokazala, da tudi 150 dodatnih ponovitev CAG ni imelo pomembnega vpliva, po presežku tega »praga« pa so raziskovalci v SPN bolnikov začeli opažati upad izražanja genov, ki se sicer izražajo v zdravih SPN in so ključni za njihovo normalno delovanje. Z naraščajočim številom CAG ponovitev so v SPN opazili tudi oslabljeno zaviranje izražanja tistih genov, ki so sicer značilni za nevrone v zgodnjem obdobju embrionalnega razvoja, in povečano izražanje genov za beljakovine, ki v nevronih spodbujajo celično staranje in apoptozo.
Povzeti izsledki podpirajo novo razlago mehanizmov v ozadju HB, ki bi jo bilo morda smiselno prekategorizirati iz »proteinopatije« (bolezni, za katero je značilno kopičenje bolezensko spremenjenih beljakovin, ki k njenemu pojavu verjetno vsaj pomembno, če ne celo vzročno prispevajo) v »transkripcionopatijo« (bolezen, kjer pomembnejšo vlogo igra spremenjeno izražanje genov – transkripcija). Toda kako razložiti dovzetnost nevronov – celic, ki se ne delijo in zato ne podvajajo svojega genskega materiala – za kopičenje tako velikega števila ponovitev CAG v mutiranem alelu HTT? Raziskovalci so se pri tem oprli na izsledke drugih raziskav, po katerih gre – poenostavljeno rečeno – za posledico napak pri popravljanju okvar DNK. Mutirani alel HTT naj bi bil zaradi že izhodiščno večjega števila ponovitev CAG v primerjavi z zdravim alelom bolj nagnjen k »izvihanju«, kar zaznajo beljakovinski kompleksi za popravljanje DNK. Ti se vežejo na izvihani del in vanj lahko vnesejo dodatne ponovitve, kar pomeni še večjo verjetnost za ponovno izvihanje in sklenitev začaranega kroga. Še zmeraj pa ni jasno, zakaj so v striatumu temu najbolj podvrženi prav SPN (in ne druge celične vrste).
Če bi v vseh SPN istočasno prišlo do opisanih sprememb, bi bilo to le stežka združljivo z relativno dolgo latentno dobo pred pojavom simptomov in znakov HB pri večini bolnikov. Avtorji raziskave so zato razvili matematični model, s katerim so preverjali, katera dinamika podaljševanja mutiranega alela HTT najbolj ustreza njihovim empiričnim izsledkom. Krivulji porazdelitve deležev SPN glede na število ponovitev CAG se je najbolj približal model, ki je predpostavljal sprva počasno, nato pa čedalje hitrejše kopičenje števila ponovitev, pri čemer se čas prehoda iz ene faze v drugo najverjetneje razlikuje med posameznimi SPN.
Na osnovi modela in empiričnih ugotovitev so oblikovali naslednjo razlago mehanizmov v ozadju HB:
- SPN bolnikov s HB se večino svojega življenja nahajajo v t.i. fazi A, ki jo označuje zložen porast števila ponovitev CAG ob naključnih izvihanjih mutiranega alela HTT. Po njihovih izračunih naj bi za SPN, ki ima izhodiščno 40 ponovitev CAG, trajalo približno 50 let, preden se število poveča na 60, in še nadaljnjih 12 let, preden bi se povečalo na 80 ponovitev. Fazo A zato primerjajo tudi z »muhasto, počasno gensko uro«;
- v fazi B (80 do 150 ponovitev CAG) se dinamika podaljševanja mutiranega alela s ponovitvami CAG v posameznem SPN pospeši na račun čedalje večje dovzetnosti za »izvihanje« mutiranega alela. Genska ura postane hitrejša in predvidljivejša, zato čas do presežka »praga« 150 ponovitev CAG zdaj znaša le še nekaj let. Obenem se izražanje genov v SPN, ki praga še ni presegel, bistveno ne spremeni, zato tudi njegovo delovanje ni pomembno okrnjeno;
- ko SPN preseže 150 ponovitev CAG (faza C), se izražanje genov začne čedalje izraziteje spreminjati. V tej fazi naj bi se zato zmanjšala tvorba beljakovin, značilnih za SPN, ki mu omogočajo normalno delovanje;
- v fazi D se z naraščajočim številom ponovitev CAG v SPN zmanjša zavora izražanja tistih genov, ki so sicer značilni za nevrone v fazi embrionalnega razvoja. Obenem se začnejo izražati geni za beljakovine, ki sprožijo apoptozo, čemur sledi sklepna faza izgube SPN – faza E.
Latentna doba je po tej razlagi odvisna predvsem od deleža SPN, ki se še nahaja v fazah A oziroma B. Ko kritično število SPN preseže prag 150 ponovitev CAG, se bolezen izrazi. Slednjo trditev raziskovalci utemeljujejo z analizo SPN pri dveh bolnikih s HB, ki sta umrla pred pojavom simptomov in znakov. Posmrtni pregled možganov ni pokazal znakov nevrodegenracije striatuma, število ponovitev CAG pri večini analiziranih SPN pa je bilo večje od podedovanega, vendar manjše od 100.
Zaključki
Osrednja najdba povzete raziskave odpira nove možnosti zdravljenja HB. Učinkovine, ki so trenutno v fazi kliničnega preizkušanja, so usmerjene predvsem v utišanje izražanja mutiranega – in domnevno toksičnega – huntingtina. Njihova doslej relativno nizka izkazana učinkovitost bi med drugim lahko izhajala iz tega, da tudi podaljšani huntingtin morda še naprej opravlja pomembne biološke naloge v SPN, da utišanje tvorbe te beljakovine ob danem času koristi le majhnemu deležu SPN (če se sicer večinoma nahajajo v fazah A ali B), ali pa da je korist utišanja HTT v fazah C in D minimalna zaradi drugih odklonov. Če povzeti izsledki prestanejo preizkušnjo nadaljnjih raziskav, bi se bilo morda bolj smiselno osredotočiti na znižanje aktivnosti beljakovinskih kompleksov za popravljanje DNK, ki prispevajo k naraščajočemu številu ponovitev CAG v SPN, ter tako bolnika čim dlje ohranjati v fazi A. Enak pristop bi se lahko obnesel tudi pri bolnikih v zgodnjih fazah klinično izražene HB (ki imajo po napovedih modela, uporabljenega v povzeti raziskavi, tudi ob 25-odstotni izgubi vseh SPN še vedno več kot 90 % preživelih SPN v fazi A). Sprememba paradigme bi lahko ponudila nov uvid tudi v razumevanje drugih genskih nevroloških bolezni, ki jih označuje podedovano podaljšanje mutiranega alela zaradi zaporedja treh nukleotidov, in olajšala zdravljenje.
Pomanjkljivosti, ki jih izpostavljajo avtorji raziskave, vključujejo preučevanje znotrajceličnega dogajanja zgolj v enem področju možganov ter osredotočenost na celično jedro in telo (kjer poteka večina beljakovinske sinteze) s posledičnim pomanjkanjem uvida v druge celične predelke. Dodatno velja izpostaviti tudi neutemeljeno zanašanje na stabilnost »podedovanega« števila ponovitev CAG, ki je pri bolnikih s HB rutinsko opredeljeno v belih krvnih celicah. Če so tudi te celice podvržene nestabilnosti števila ponovitev CAG v mutiranem alelu HTT, bi bilo omenjeno nestabilnost potrebno izmeriti oziroma opredeliti ter ustrezno prirediti standard za primerjavo in vrednotenje somatskega mozaicizma v ostalih tkvih bolnikov s HB. Čeprav raziskovalci s pomočjo matematičnega modela opisujejo vzročno povezanost med številom ponovitev CAG ter delovanjem in preživetjem SPN, to zgolj iz empiričnih izsledkov ni samoumevno. Za celostno razumevanje dogajanja pri HB bodo potrebne nadaljnje raziskave, ki jo bodo preučile iz drugačnih zornih kotov – vsekakor pa drži, da jim povzeta raziskava ponuja številne nove iztočnice.
Povzela: Lana Blinc, dr. med.
Bibliografski podatki o objavi
- Handsaker RE, Kashin S, Reed NM, Ichihara K, Beretta S, McCarroll SA, et al. Long somatic DNA-repeat expansion drives neurodegeneration in Huntington's disease. Cell. 2025;188:1-17. DOI: 10.1016/j.cell.2024.11.038